Préparation du vecteur
La préparation du vecteur consiste à linéariser un plasmide circulaire et à obtenir des extrémités compatibles avec celles de l'insert. Cette étape est déterminante pour l'efficacité et la spécificité du clonage.
La préparation du vecteur repose sur plusieurs étapes successives :
- La linéarisation par digestion enzymatique du vecteur au niveau du site multiple de clonage (MCS),
- La déphosphorylation éventuelle des extrémités,
- La purification et la quantification du vecteur linéarisé.
1- Linéarisation
Le vecteur est linéarisé par digestion au niveau du MCS (site Multiple de Clonage). Le choix des enzymes dépend de l'objectif :
Clonage non directionnel
- digestion avec une seul enzyme de restriction qui génère des extrémités identiques. Dans ce cas l'orientation de l'insert est aléatoire, il est indispensable de déphosphoryler le vecteur après digestion pour éviter sa recircularisation.
Clonage directionnel
- digestion avec deux enzymes non compatibles qui impose une seule orientation de l'insert.
Pourquoi orienter l'insert ?
Dans le cas d'un clonage d'expression, l'orientation de l'insert est cruciale. La transcription du gène d'intérêt ne peut avoir lieu que si celui-ci est inséré dans le sens correct par rapport au promoteur du vecteur.
2- Déphosphorylation
La déphosphorylation élimine les groupements 5' phosphate du vecteur, rendant impossible la ligation en absence d'insert.
Dans le cas d'un clonage non directionnel, la déphosphorylation est indispensable pour empêcher la recircularisation du vecteur sur lui-même. Pour rappel, la ligation entre deux fragments d'ADN n'est possible qu'entre une extrémité 5'P et une extrémité 3'OH.
Les phosphatases couramment utilisées sont:
- La CIP (Calf Intestinal Phosphatase)
Très efficace mais difficile à inactiver car thermostable. - La SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) et SAPr
Thermosensibles, facile à inactiver (15min à 65°C), largement utilisées en pratique.
L'efficacité de la déphosphorylation sera vérifiée par une ligation témoin sans insert. Dans ce cas, aucune colonie bactérienne ne doit être obtenue après transformation.
3- Purification et quantification
Le vecteur linéarisé et déphosphorylé est extrait après électrophorèse (les formes linéaires et circulaire du vecteur sont alors séparées). L'ADN est purifié (colonne, billes magnétiques) afin d'éliminer les enzymes et fragments non spécifiques.
Quelques soit la méthode utilisée, l'ADN plasmidique doit être dosé (par spectrophotométrie ou fluorométrie) afin d'ajuster précisément les rapports insert/vecteur lors de la ligation.
