PCR: généralités et animation
Historique
Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN.
Principe
La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle (amplicons) servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle.
Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes.
- Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin : dénaturation.
- Borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques : hybridation.
- Réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin : polymérisation.
Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique. Pour effectuer ces transitions de températures, les microtubes contenant le mélange réactionnel sont placés dans un appareil programmable : un thermocycleur. Cet appareil présente un bloc chauffant qui permet d’exposer les tubes qui contiennent le mélange réactionnel à des températures choisies et pour des durées déterminées par l’expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide et ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).
-> Optimisation de la réaction PCR
