Purification de l'ADN plasmidique

Principe

L'ADN plasmidique est isolé à partir de bactéries transformées. La difficulté ici est de séparer l'ADN plasmidique de l'ADN chromosomique de la cellule hôte. Pour ce faire, on va jouer sur les différences de comportement de ces deux ADN lors d'une expérience de dénaturation/renaturation.

• l'ADN plasmidique peut se renaturer correctement car circulaire et de petite taille.
• l'ADN bactérien trop long, ne peut pas se renaturer correctement et précipite.

Types de préparation plasmidiques

Selon le volume de culture bactérienne utilisé et la quantité d'ADN plasmidique souhaitée, on distingue plusieurs type de préparations:

Purification par lyse alcaline.

La méthode classique de purification de l'ADN plasmidique repose sur la lyse alcaline des bactéries. Cette lyse est obtenue par l'action combinée du SDS (qui solubilise les membranes cellulaires et dénature les protéines) et de la soude, NaOH (qui provoque la dénaturation de l'ADN). Après cette étape, une neutralisation est réalisée afin de permettre une renaturation sélective de l'ADN plasmidique, tandis que l'ADN bactérien et les protéines précipitent.

Les étapes de la miniprep par lyse alcaline.

(Voir les numéros des étapes sur le figure)

• 1+2 Des bactéries prélevées à partir de colonies isolées sur boîte de Pétri, sont mises en culture pendant la nuit dans un milieu liquide contenant l'antibiotique de sélection aproprié.
• 3+4 Après croissance, les bactéries sont récoltées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon neutre. Cette étape permet réduire le volume et de mettre les bactéries dans un tampon compatible avec les étapes suivantes.
• 5 La lyse est effectuée par ajout d’une solution dénaturante soude/SDS. Les ADN bactérien et plasmidiques sont dénaturés sous forme simple brin, les membranes sont rompues et les protéines dénaturées.
• 6 La neutralisation est obtenue par l’ajout d’un tampon acide. Le pH est abaissé, ce qui provoque la précipitation des protéines et de l’ADN chromosomique qui est trop grand pour se renaturer correctement. L’ADN plasmidique, plus petit et circulaire, est renaturé correctement et reste en solution.
• 7 Après centrifugation, le surnageant qui contient l'ADN plasmidique est récupéré par pipetage. Le culot qui contient les protéines précipitées, les fragments de cellules et l’ADN chromosomique bactérien dénaturé, est éliminé.

A partir de cette étape, l’ADN plasmidique peut être purifié par précipitation à l’alcool comme vu au chapitre précédent « préparation d'ADN génomique ».

Les étapes de mélange et de remise en suspension doivent être réalisées avec précaution. Une agitation trop vigoureuse peut casser l'ADN génomique et engendrer des fragments plus petits susceptibles de contaminer la solution d’ADN plasmidique.

Purification par colonnes de silice

Les fournisseurs de laboratoire proposent des kit de purification d'ADN qui utilisent des colonnes de centrifugation contenant une membrane de silice (voir chapitre précédent « préparation d'ADN génomique »). Pour rappel, dans des conditions de forte concentration en sels chaotropiques, l'ADN se fixe à la silice, tandis que els contaminants sont éliminés par des lavages successifs.

La procédure est rapide, reproductible et permet d'obtenir un ADN plasmidique de haute qualité directement utilisable pour le clonage.