Les kinases

Définition

Les kinases catalysent le transfert d'un groupement phosphate (PO43-) depuis une molécule donneuse riche en énergie, généralement le phosphate en position gamma de l'ATP, vers un substrat accepteur, conduisant à la formation d'une liaison phosphoester.

Utilisation des kinases en biologie moléculaire

Dans le cadre d'un clonage d'ADN, la polynucléotide kinase du phage T4 (PNK T4) est couramment utilisée. Cette enzyme peut agir sur des acides nucéiques simples ou doubles brins (ARN ou ADN).

Elle a deux activités principales :

  • Une activité 5'-kinase, qui catalyse le transfert du phosphate γ (gamma) de l’ATP vers une extrémité 5'-OH d'un acide nucléique.
  • Une activité 3'-phosphatase, capable de retirer un phosphate d'une extrémité 3'-phosphate.

Dans le contexte des manipulations de clonage, c'est l'activité 5'-kinase qui est exploitée.

Lors du clonage, avant ligation.

L'étape de ligation est cruciale pour la réussite du clonage. Pour rappel, la ligation ne peut se faire qu'entre une extrémité 3'-OH et une extrémité 5'-P.
Comme, le vecteur digéré est généralement déphosphorylé avant la ligation afin de limiter sa recircularisation spontanée, il est indispensable de s'assurer que l'ADN d'intérêt (l'insert) possède des extrémités 5' phosphorylées pour permettre la ligation entre le vecteur et l'insert.

Cas particulier : les oligonucléotides amorces utilisés pour les PCR sont produits par synthèse chimique et possèdent une extrémité 5'-OH, donc les fragments obtenus après PCR ont des extrémités 5'-OH qui doivent être phosphorylées avant l'étape de ligation.

Utilisation des kinase pour le radiomarquage

Les kinases, en particulier la PNK T4, sont également utilisées pour marquer l’ADN avec des isotopes radioactifs du phosphate. (voir annexe § marquage sonde)

En utilisant de l'ATP radiomarqué sur le phosphate en position gamma (γ-³²P-ATP), la T4 PNK transfère le phosphate radioactif sur l'extrémité 5'-OH de l'ADN à marquer.

On obtient ainsi une sonde facilement détectable en autoradiographie.

Remarque:
Il n'est pas possible de phosphoryler un ADN au niveau de son extrémité 5' si un groupement phosphate est déjà présent. Dans le cas d'un marquage en 5', l'ADN doit être  préalablement traité par une phosphatase qui retire le phosphate existant générant une extrémité 5'OH qui pourra être phosphorylée.
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