Stratégie expérimentale
Le choix d'une stratégie de clonage dépend de nombreux paramètres, taille du fragment, présence de sites de restriction, orientation souhaitée, expression ultérieure du gène, etc.
Ce chapitre présente les approches classiques basées sur la restriction/ligation ainsi que les méthodes qui impliquent la PCR.
Analyse de séquence
L'analyse bioinformatique de la séquence d'ADN à cloner permet de choisir les enzymes et stratégies expérimentales. Cette analyse repose sur l'utilisation de logiciels spécialisés comme SnapGene, NCBI ORF Finder par exemple.
ORF
Une ORF (Open Reading Frame) correspond à une séquence d'ADN susceptible de coder une protéine. Elle débute par un codon start (ATG) et se termine par un codon stop (TAA, TAG ou TGA) tous les deux dans le même cadre de lecture.
On peut ainsi,
- identifier la séquence codante d'intérêt,
- déterminer la taille théorique de la protéine (en acides aminés).
Sites de restriction
Dans le cas de clonage classique avec enzymes de restriction, il est important de vérifier l'absence de site de restriction correspondant à l'intérieur de la séquence d'intérêt.
Même si elles sont plus couteuses, il est possible de contourner ce problème avec des méthodes alternatives de clonage sans restriction comme par exemple l'assemblage de Gibson.
Cadre de lecture
Dans le cas d'un clonage dans un vecteur d'expression, le cadre de lecture doit être respecté lors de l'insertion de la séquence d'intérêt.
Pour que la séquence d'intérêt soit correctement exprimée, il est important de vérifier sa position et son oriengtation par rapport :
- au promoteur
- aux éventuels séquences des protéines marqueures en amont et éviter le décalage de cadre de lecture qui modifierait la séquence protéique.
Méthode de clonage
Le choix de la stratégie de clonage dépend des objectifs expérimentaux et des contraintes techniques.
Les principaux critères sont :
- La taille du fragment,
- Le nombre de construction,
- les contraintes de temps,
- l'insertion directionnelle ou non,
- les modifications in vitro ou in vivo.
| Critère | Situation | Choix de la méthode | Pourquoi |
|---|---|---|---|
| Taille du fragment | Fragment court à moyen (<3kpb) | Clonage classique (digestion/ligation) | Méthode simple et suffisante |
| Fragment long ((>5kpb) | Méthodes modernes (Gibson) | Meilleur rendement pour grands fragments | |
| Nombre de construction | Construction unique | Clonage classique (digestion/ligation) | Economique et adapté |
| Multiples variants | Méthodes modernes (Gateway) | Gain de temps et efficacité | |
| Temps | Délais flexible | Clonage classique (digestion/ligation) | Etapes successives gérables |
| Délais court | Méthodes modernes | Assemblage rapide en une étape | |
| Orientation de l'insert | Orientation aléatoire | Clonage classique ou modernes | Une seule enzyme possible |
| Orientation imposée | Clonage classique ou modernes | Contrôle de l'orientation | |
| Type de modification | Construction plasmidique in vitro | Clonage classique ou modernes | Adapté à l'expression ou étude fonctionnelle |
| Modification génomique in vivo * | Méthode moderne avec édition ciblée (CRISPR) | Intervention directe dans le génome |
* Modification génomique in vivo n'est pas considéré comme un clonage au sens classique du terme.
Retour au sommaire
