Préparation de l'insert
Le fragment d'ADN d'intérêt (insert) doit présenter des extrémités compatibles avec celles du vecteur pour faciliter la ligation.
L'insert peut être obtenu :
- après digestion enzymatique
- après PCR, avec ou sans ajout de sites de restriction à ses extrémités.
Insert généré par digestion
Les fragments d'ADN obtenus après digestion enzymatique sont naturellement phosphorylés.
Cette méthode est particulièrement adaptée lorsqu'il faut isoler l'insert présent dans un plasmide. En revanche, la digestion est peu efficace pour isoler un fragment à partir d'ADN génomique.
Insert obtenu après PCR
La PCR permet d'obtenir rapidement une grande quantité d'ADN d'une région spécifique à partir de n'importe quelle matrice.
Cependant, les produits PCR ne sont pas phosphorylés (les amorces synthétiques ont une extrémité 5'OH, une phosphorylation du produit PCR est donc nécessaire en particulier pour une ligation avec un vecteur déphosphorylé.
Modifications des extrémités de l'insert
Lorsque les extrémités de l'insert et du vecteur ne sont pas compatibles, elles peuvent être modifiées :
- par comblement des surplombs 5',
- par élimination des surplombs 3',
- par introduction de sites de restriction.
Modification des extrémités cohésives en extrémités franches
Le choix de la transformation des extrémités cohésives en extrémités franches se présente quand il n'y a aucun site de restriction compatible entre vecteur et insert.
Dans ce cas, la ligation sera entre extrémités franches.
Les enzymes utilisées pour le comblement ou l'élimination des extrémités sortantes sont :
- L'ADN T4 polymérase ou le fragment Klenow qui ont
- une activité polymérase 5'-3',
- une activité exonucléasique 3'-5'.
- La Nucléase S1 qui :
- dégrade toutes les régions simple brin (surplombs 3' et 5').
Voir les chapitres sur les polymérases et exonucléases.
Ajout d'extrémités cohésives artificielles par PCR
Clonage TA
Certaines ADN polymérases, comme la Taq polymérase, ajoutent une adénine non appariée en 3' aux produits PCR.
Il est alors recommandé d'utiliser les vecteurs TA qui possèdent des extrémités 3'-T complémentaires et qui permettent une ligation rapide et sans digestion préalable de l'insert.
Ajout de sites de restriction par PCR
La PCR permet d'isoler la région d'ADN à cloner mais également d'ajouter artificiellement des sites de restriction aux extrémités de l'insert (voir figure suivante).
Les oligonucléotides amorces présentent alors :
- en 3', la séquence complémentaire de la région hybridée,
- en 5', une extension contenant un site de restriction sous forme simple brin avec 4 à 6 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' pour une digestion efficace.
Le produit PCR est ensuite digéré par l'enzyme de restriction correspondante au site introduit artificiellement (voir figure suivante). L'ADN obtenu présente des extrémités cohésives et phosphorylées qui nécessitent cependant une purification avant la ligation.
Choix des amorces
Quelque soit la PCR envisagée, il faut déterminer la séquence des amorces à utiliser. Les amorces fonctionnent par paire pour délimiter la région d'ADN à amplifier en s'hybridant aux extrémités de la séquence cible. Les deux amorces doivent :
- être complémentaires des extrémités de la région cible (en particulier les 3'OH de chaque amorce)
- avoir des température de fusion (Tm) proches,
- éviter toute complémentarité entre elles et ne pas former de structures secondaires internes (épingles à cheveux),
(voir § PCR)
Purification et quantification
La taille de l'insert est contrôlée par électrophorèse afin de vérifier:
- la taille attendue du fragment
- l'absence de produits non spécifiques.
L'insert est ensuite purifié pour éliminer:
- les amorces résiduelles, les dNTP et la Taq polymérase
- les enzymes de restriction et les fragments parasites.
Quelques soit la méthode utilisée, l'insert doit être dosé (par spectrophotométrie ou fluorométrie) afin d'ajuster précisément les rapports insert/vecteur lors de la ligation.
