Méthodes modernes de clonage

Le clonage classique par enzymes de restriction et ligation, bien qu'efficace, présente des limites majeures. Ainsi, il est parfois impossible d'utiliser des enzymes de restriction qui risquent de couper le gène d'intérêt et le rendre inutilisable pour l'expression ultérieure. De plus, lors du clonage de grands fragments, le rendement est faible et le criblage des colonies est laborieux car chronophage.
Les avancées technologiques ont permis depuis le début des années 2000 le développement de méthodes de clonage qui ne dépendent pas de la présence de sites de restriction internes dans la séquence d'intérêt. Elles reposent sur des systèmes enzymatiques spécifiques assurant recombinaison, assemblage ou édition ciblée de l'ADN.
On présente ici les principales technologies utilisées:

• Gateway (recombinaison site-spécifique)
• Gibson Assembly (assemblage par homologie in vitro)
• CRISPR-Cas9 (édition génomique in vivo).

Méthode Gateway cloning

La méthode Gateway repose sur le mécanisme naturel de recombinaison site-spécifique du bactériophage lambda via les sites att :

• attB (bacterial),
• attP (phage),
• attL (left),
• attR (right).

Cette approche permet un transfert rapide, orienté et très efficace de fragments d'ADN entre vecteurs, sans enzymes de restriction ni ligase.

In vivo, le phage lambda s'intègre dans le génome bactérien par recombinaison entre les sites attP et attB, générant les sites attL et attR.
Deux réactions sont utilisées, les réactions BP (attBxattP) et LR (attLxattR).

Protocole de la méthode Gateway:

1. Réaction BP, création d'un clone d'entrée contenant des sites attL, par recombinaison entre fragment d'ADN (avec site attB) et un vecteur donneur (attP). Cette réaction est catalysée par un mélange enzymatique, BP clonase^TM, qui contient principalement l'intégrase (Int) et le facteur d'intégration bactérien (IHF).
2. Réaction LR, recombinaison entre le clone d'entrée (attL) et un vecteur de destination(attR) qui génère le clone d'expression final. Cette réaction est catalysée par un mélange enzymatique LR clonase^TM, qui contient l'intégrase (Int) et le facteur d'intégration bactérien (IHF) et l'exicisionase (Xis).

Les vecteurs de destination contiennent le gène toxique ccdB.Les plasmides non recombinés conservent ccdB et ne survivent pas dans des souches bactériennes standards (par ex DHaα).

• Avantages:
  • Très haute efficacité de recombinaison,
  • Directionalité garantie,
  • Conservation du cadre de lecture,
  • Standardisation des vecteurs,
  • Idéal pour le transfert d'un insert vers pluseiurs vecteurs d'expression
• Limites:
  • Coût élevé (sous licence commerciale),
  • Impossibilité de cloner des séquences contenant des sites att,
  • Moins flexible pour des assemblages complexes multiples (bien que des variantes comme le système MAGIC (Multisite Assembly of GatewayInduced Clones) existent.

Assemblage de Gibson

Développé par D.Gibson en 2009, cette méthode permet l'assemblage simultané de plusieurs fragments d'ADN partageant des régions homologues (20 à 40 pb). La réaction se fait en une seule étape grâce à un mélange de trois enzymes:

1. Une exonucléase (exo 5’-3’)
   dégrade les extrémités 5'
   génère des extrémités 3' simple brin complémentaires.
2. Une ADN polymérase thermostable
   comble les brèches après hybridation des régions homologues.
3. Une ADN ligase thermostable
   scelle les fragments d'ADN assemblés.

Pour cette réaction, il faut:

• des fragments d'ADN linéaires,
• des régions chevauchantes homologues (20 à 40 pb),
• un mélange équimolaire optimisé,
• un tampon optimisé contenant dNTP, Mg2+, NAD+.

Protocole de la méthode d'assemblage de Gibson:

1. Conception des amorces PCR avec régions homologies chevauchantes
2. Amplification et purification des fragments
3. Incubation avec le mix Gibson (1h à 50°C),
4. Transformation bactérienne
5. Vérification des colonies par PCR ou séquençage.

• Avantages:
  • indépendant des sites de restriction,
  • assemblage de plusieurs fragments (jusqu'à 15 fragments),
  • compatibles avec des fragments de grande taille
• Limites :
  • nécessite la conception de régions homologues,
  • l'efficacité diminue quand le nombre de fragment augmente,
  • le coût des enzymes.

CRISPR-Cas9

Contrairement à Gateway et Gibson assembly, CRISPR-Cas9 modifie directement le génome cellulaire et ne correspond pas à une méthode de clonage plasmidique.

CRISPR-Cas9 est un système d'édition génomique dérivé de l'immunité bactérienne. Il repose sur deux éléments :

• un ARN guide (sgRNA):
  • ARN chimérique non codant de 20nt complémentaire à la séquence cible.
• une endonucléase (Cas9):
  • qui casse l'ADN double brin en présence d'un motif PAM (NGG).

Après cassure, deux voies de réparation cellulaire sont possibles :

• NHEJ (Non homologous End Joining) qui permet :
  • réparation rapide,
  • l'introduction de indels (insertions/délétions)
  • les Knock-out,
• HDR (Homologous Directed Repair) qui avec un ADN donneur, permet :
  • une insertion ou correction ciblée (knock-in)

HDR est moins efficace que la NHEJ.

Protocole et applications

Le système peut être introduit dans les cellules sous différentes formes:

• plasmide codant Cas9+sgRNA
• ARNm
• complexe ribonucléoprotéique (protéine Cas9+sgRNA)
• vecteurs viraux.

• Avantages :
  • modification ciblée précise,
  • applications in vivo en recherche et biomédicale
  • création rapide de modèles cellulaires ou animaux.
• Limites :
  • risques de coupures hors cible,
  • efficacité variable selon le type cellulaire,
  • necessité de validation des clones édités

Synthèse comparative

Le choix de la méthode dépend de l'objectif :

• Gateway est idéal pour des projets qui nécessitent des transferts standardisés entre vecteurs, malgré son coût.
• Gibson assembly est une méthode de choix pour l'assemblage de grands fragments ou de constructions complexes.
• CRISPR-Cas9 ouvre la voie à la modification directe du génome.

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