Réaction de ligation
La ligation permet d'assembler par une liaison covalente l'insert et le vecteur. Cette réaction est catalysée par la T4 ADN ligase, une enzyme capable de former une liaison phosphoester entre une extrémité 3'-OH et une extrémité 5'-P, en présence d'ATP.
Conditions de ligation
L'efficacité de ligation dépend:
- du type d'extrémités à liguer (cohésives ou franches),
- de la température (16°C optimal),
- du ratio molaire insert/vecteur.
Extrémités cohésives ou franches
La ligation est facilitée en présence d'extrémités cohésives:
- Réaction rapide et efficace
- Possible à 16°C ou 4°C
Cependant, la ligation d'extrémités franches reste possible. Il faut alors ajuster les conditions expérimentales.
- Augmenter les concentrations en ADN,
- Augmenter la durée d'incubation (souvent sur la nuit, ON),
- Ajouter du PEG (PolyEthylène Glycol) pour améliorer le rendement.
La ligation n'est possible qu'entre une extrémité 3'-OH et une extrémité 5'-P, hors le plasmide est le plus souvent déphosphorylé. Dans ce cas, seules les liaisons entre les extrémités 5'P de l'insert et les extrémités 3'OH du vecteur sont formées. Ce qui permet de stabiliser l'insert dans le vecteur.
Les brêches (nick) entre les extrémités 5'OH du vecteur et les extrémités 3'OH de l'insert sont réparés, in vivo, après transformation grâce aux systèmes de réparation de la bactérie hôte.
Température
Différentes températures de ligation sont possibles :
- 16°C, c'est la température optimale, un compromis entre l'activité enzymatqiue et la stabilité des interactions ADN-ADN
- 4°C, est utilisée pour des ligations longues (sur la nuit, ON), notamment pour les extrémités franches.
- 25°C, peut être choisie pour des ligations rapides avec des extrémités cohésives.
Ratio molaire insert/vecteur
Le rapport molaire entre l'insert et le vecteur est un paramètre clef pour la réussite de la ligation.
Ce rapport doit être compris entre:
- 3:1 à 5:1, pour les extrémités cohésives
- 5:1 à 10:1, pour les extrémités franches
Ces rapports sont exprimés en moles et tiennent compte de la taille respective de l'insert et du vecteur.
Protocole
Le mélange de ligation est préparée avec :
- ADN vecteur: 50 à 100 ng
- ADN insert:quantité calculée selon le rapport molaire souhaité
- Tampon de ligation 1X
- T4 ADN ligase (en dernier) : 1 unité
- Eau ultra-pure: qsp volume 10 ou 20 µL.
L'incubation se fait:
- soit à 16°C pendant 12 à 16 heures
- soit à température ambiante pendant 1 heure pour des ligations simples à extrémités cohésives
Exemple de calculs pour une ligation ADN
Données :
Préparer une réaction de ligation entre un vecteur plasmidique et un fragment d'ADN (insert) avec des extrémités cohésives. On a les données suivantes:
| Paramètres | Valeurs |
| taille du vecteur | 3 kpb |
| concentration du vecteur | 25 ng/µL |
| quantité de vecteur utilisé | 50 ng |
| taille de l'insert | 1,5 kpb |
| concentration de l'insert | 30 ng/µL |
| rapport molaire souhaité (insert/vecteur) | 3:1 |
| volume final de la réaction de ligation | 10µL |
Calculs:
- Le volume de vecteur à utiliser (µL) ?
volume de vecteur=masse/concentration
volume de vecteur=50/25=2 µL - Masse d'insert à ajouter pour avoir un rapport molaire de 3:1 ?
masse de l'insert=masse vecteur x (taille insert/taille vecteur) x rapport molaire
= 50 x (1,5/3) x 3/1 = 50 x 0,5 x 3 = 75 ng - Volume d'insert à ajouter ?
volume d'insert= masse calculée/concentration
volume d'insert=75/30=2,5 µL
- Composition (en µL) du mélange réactionnel
| Composant | volume (µL) |
| Vecteur (25ng/µL) | 2,0 |
| Insert (30ng/µL) | 2,5 |
| Tampon de ligation 10X | 1,0 |
| T4 DNA ligase (1U/µL) | 0,5 |
| Eau stérile (qsp 10µL) | 4 |
A l'issue de l'incubation, le produit est directement utilisé pour la transformation des bactéries compétentes.
