Les ligases
Définition
Les ligases sont essentielles dans le processus d'assemblage des oligonucléotides. Elles catalysent la formation d'une liaison phosphoester entre les extrémités 3'-OH et 5'-P de deux fragments d'ADN. Elle n'ajoutent pas de nucléotides.
La ligase T4 (du bactériophage T4) joue un rôle clef dans le clonage, lors de la réparation et de l'assemblage de fragments d'ADN. C'est une ligase très efficace capable de liguer presque tous les types d'extrémités d'ADN (extrémités franches ou cohésives).
La ligase T4
La ligation: une réaction en 3 étapes
La T4 ligase catalyse la formation d'une liaison phosphoester. Pour agir, la ligase doit être activée.
La réaction de ligation se déroule en trois étapes:
- L'activation de l'enzyme (l'adénylation): l'enzyme réagit avec l'ATP et forme un intermédiaire ligase-AMP
- L'activation de l'ADN: l'AMP est transféré sur l'extrémité 5'-P de l'ADN et forme un intermédiaire ADN-AMP activé
- Formation de la liaison phosphoester: l'extrémité 3'OH attaque le 5' P (attaque nucléophile) et forme la liaison phosphoester avec libération d'AMP.
Cette réaction nécessite la présence de Mg2+. Si la T4 fonctionne avec l'ATP, il existe d'autres ligases (comme la ligase d'E.coli) qui utilisent du NAD+ comme cofacteur.
Autres ligases
Pour certaines réactions de ligation, il est possible d'utiliser des ligases alternatives.
- La ligase d'E.coli, peu utilisée en clonage classique, fonctionne uniquement sur les extrémités cohésives d'ADN ou les brêches au sein de l'ADN. Elle utilise du NAD+ comme cofacteur.
- Les ligases thermostables, comme Ampligase et Taq DNA ligase qui sont utiliser en LCR (=Ligase Chain Reaction). Cette méthode combine ligation pour joindre des sondes et PCR générant une amplification spécifique et efficace.
- Les ligases modifiées (mutantes) ont une meilleure efficacité sur les extrémités franches, avec une température d'activité optimum de 25°C, elle tolère mieux les additifs comme le polyEthylèneGlycol (PEG).
