La digestion
Principe
La digestion consiste à hydrolyser l'ADN double brin au niveau de sites spécifiques (sites de restriction) grâce à des enzymes de restriction de type II, afin de générer des fragments exploitables pour le clonage.
Conditions expérimentales
Une digestion efficace dépend de plusieurs paramètres :
- le rapport enzyme/ADN
En générale, on utilise 1 à 10 unités enzymatique (UI) par µg d'ADN.
Pour un clonage, la digestion est volontairement en excès (5 à 10 fois la quantité minimale d'enzyme) pour sécuriser la coupure. - la température et la durée d'incubation
La température optimale est de 37°C pour la majorité des enzymes de restriction.
La durée d'incubation est de 20min à 1 heure. Une incubation prolongée (sur la nuit, overnight) est possible avec moins d'enzyme. - le tampon réactionnel
Le tampon assure le pH optimal, la force ionique, la présence de cations bivalents (Mg2+) et la stabilité enzymatique.
Double digestion et enzymes compatibles
La digestion par 2 enzymes de restriction différentes permet un clonage directionnel, qui impose une orientation unique de l'insert et limite la recircularisation du vecteur.
Choix du tampon
Dans le cas d'une double digestion, il faut s'assurer qu'un tampon compatible existe ou que les conditions de tampon peuvent être ajustées sans perte d'activité. Trois situations sont possibles :
- Tampon commun optimal
Les deux enzymes sont actives dans le même tampon, dans ce cas la digestion est simultanée et optimum pour les deux enzymes. - Tampon compatible
Les enzymes conservent au moins 75% de leurs activités dans un tampon commun, l'incubation est simultanée et si besoin prolongée. - Aucun tampon compatible
Deux digestions successives sont nécessaires avec une purification intermédiaire.
Le tableau de compatibilité ci-dessous présente l'efficacité d'activité de quelques enzymes dans les tampons 1, 2 et 3 à 37°C. Ces tampons sont fournis avec les enzymes.
| Enzymes | Site de restriction | % activité dans Tampon1 |
% activité dans Tampon2 | % activité dans Tampon3 |
| EcoRI | G/AATTC | 25 | 100 | 50 |
| KpnI | GGTAC/C | 100 | 75 | 10 |
| PstI | CTGCA/G |
75 |
75 | 100 |
| SpeI | A/CTAGT | 75 | 100 | 25 |
| XbaI | T/CTAGA | 10 | 100 | 75 |
| XhoI | C/TCGAG | 75 | 100 | 100 |
Les enzymes compatibles
Les enzymes de restriction compatibles reconnaissent des sites de restriction différents mais génèrent des extrémités cohésives identiques.
Exemple d'enzymes qui génèrent l'extrémité 5' sortante 5'-GATC-3' :
- BamHI (G/GATCC),
- BglII (A/GATCT),
- BclI (T/GATC),
- MboI (/GATC)
Ces enzymes permettent des ligations croisées, mais non «recoupable» après ligation. Voir la figure ci-dessous
Exemples de BamHI et BglII qui génèrent des extrémités compatibles 5' sortantes.
Enzymes de restriction « compatibles » [pdf, fr]
Produits de la digestion
La réaction d'hydrolyse génère des fragments de restriction avec :
- une extrémité 5' phosphate (5’P)
- une extrémité 3' hydroxyle (3’OH)
Ces extrémités sont indispensables à la réaction de ligation ultérieure.
L'hydrolyse par EcoRI génère des extrémités cohésives 5' sortantes (appelés aussi bouts collants), capables de s'hybrider à des séquences complémentaires.
Protocole
Un protocole de digestion enzymatique comprend classiquement quatre étapes :
- Préparation du mélange de réactionnel
- Incubation à une température optimale
- Arrêt de la réaction enzymatique
- Analyse des produits de digestion par électrophorèse.
1- Préparation du mélange réactionnel
Le mélange réactionnel est préparé dans un microtube, sur la glace, pour un volume final généralement compris entre 20 à 50 µl.
Exemple de mélange pour une digestion simple :
| Composant | Condition finale dans 50µL |
| ADN | 1 µg |
| eau stérile | qsp(1) 50µL |
| Tampon(2) 10X(3) | 1X |
| Enzyme de restriction | 5 à 10 UI(4) |
Notes et remarques :
- (1)qsp : pour « quantité suffisante pour », c'est à dire le volume à ajouter pour avoir un volume final souhaité.
- (2)Tampon, le tampon impose le pH, la force ionique et les cofacteurs nécessaire. Certaines enzymes nécessitent des additifs (DTT, BSA, ATP)
- (3)10X : indique le niveau de concentration du tampon. Autrement dit, c'est le facteur de dilution à appliquer pour avoir une concentration finale de 1X.
- (4)UI : unité enzymatique définit comme suit:
Une unité d’enzymatique correspond à la quantité d'enzyme nécessaire pour digérer complètement 1μg d'ADN témoin en 1h dans 50 μL, dans des conditions optimales définies par le fournisseur.
L'enzyme est ajoutée en dernier, après homogéniqation du prémélange.
Un bref passage en centrifugeuse permet de collecter le liquide au fond du tube avant l'étape d'incubation.
2- Incubation
La digestion est réalisée à la température optimale de l'enzyme. La majorité des enzymes agissent à 37°C.
Exceptions notables :
- TaqI à 65°C
- SmaI à 25°C
- SapI à 30°C
La durée d'incubation varie de 20 min à 1 heure.
Une digestion sur la nuit (over night, ON) est possible mais avec une quantité réduite d'enzyme afin d'éviter des artefacts.
3- Arrêt de la réaction
La digestion peut être stoppée par deux façons :
- Ajout d'EDTA :
chélateur de cations bivalents (Mg2+), il inhibe l’activité enzymatique. Méthode adapté si aucune autre réaction enzymatique ne suit. - Inactivation thermique :
Chauffage à 65°C pendant 10 à 20 min. Attention, certaines enzymes sont thermostables.
4- Analyse des produits de digestion
Les fragments d’ADN sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose, en présence de témoins :
- l'ADN non digéré (contrôle d'intégrité)
- un marqueur de taille (ladder)
Cette analyse permet de vérifier :
- l'efficacité de la digestion
- La taille des fragments obtenus
- L'absence d'hydrolyse non spécifique
Purification de l'ADN après digestion
Cette étape est essentielle avant l'étape de ligation.
Après électrophorèse, le fragment d’ADN d’intérêt peut être isolé à partir du gel d'agarose. La bande correspondante est découpée puis l'ADN est purifié (colonne, billes magnétiques) afin d'éliminer les enzymes et fragments non spécifiques.
Artefact de réaction: la Star activity
La star activity correspond à une perte de spécificité de l'enzyme, entrainant des coupures non spécifiques de l'ADN.
Les causes principales sont :
- Un excès d'enzyme (>100 UI/µg d'ADN)
- Une concentration excessive de glycérol (>5%). (Les enzymes sont conservées dans 50% de glycérol).
- Des conditions sub-optimales (pH, température, force ionique inadaptés)
- Un temps d'incubation trop long
En prévention, il convient de :
- respecter les recommandations du fournisseur
- limiter la quantité d'enzyme
- utiliser des tampons adaptés
- éviter les dilutions d'enzyme sans glycérol.
